1. 분리능에 따른 분류

 질량분석계에서 분리능(Resolution)은 그들의 질량 대 전하비(mass charge, m/z)에 따라서 서로 가까운 질량 이온들을 분리 할 수 있는 질량 분석계의 분석관의 성능을 나타낸다. 분리능은 상업적으로 제작 판매된 질량 분석계 분리 시스템의 고유한 성능으로서, 고분리능 질량 분석계와 저분리능 질량 분석계로 나누어진다.  크로마코그래프 기기에 의해서 물질들이 물리적으로 분리된 후 온라인 상태에서 질량 분석계로 주입되는 경우에는 각 성분의 질량 스펙트럼이 같을지라도 정성, 정량 분석에는 지장이 없지만 다이옥신과 같은 cogender가 많은 물질의 경우에는 크로마토그래프 기기에서 잘 분석이 안될뿐만 아니라 질량 스펙트럼도 거의 비슷하기 때문에 정성, 정량분석이 불가능하게 되는데 이때는 고분리능 질량 분석계를 사용하면 이들에 대한 분리가 가능해진다. 고분리능은 C, H, N, O 등으로 구성된 화합물들을 구분하는 분리능이 10,000 이상인 것을 가리키며 고분리능 질량 분석계(HRMS: high resolution mass spectometer)라 한다. HRMS가 가능한 분석 기기는 분석시 설정하는 조건에 따라 LRMS도 가능하다. HRMS의 스펙트럼을 해석할 때는 분석시 설정한 분리능에 따라 다르지만 보통 이온 질량이 소수점 셋째 자리에서 넷짜리까지가 모두 의미가 있으므로 분자나 원자들의 정확한 질량을 계산해야한다. 저분리능(LRMS : low resolution mass spectometer)은 nominal ion mass에 따라서 분리하는 것으로 단위 분리능(unit resolution)또는 LRMS 질량 분석계라 하며, 일반적으로 특별한 언급이 없으면 LRMS 기종으로 생각하면 된다. LRMS의 경우에는 종종 실험자들 가운데서는 분자량을 소수점 셋째 자리까지도 계산하는 경우가 있는데, 이것은 질량 분석계를 이해하지 못하기 때문이다. 저분리능 질량분석계에서는 언자들의 질량을 C:12, H:1, N:14 드으로 계산하여야 하며 특히 Cl의 경우에는 35.5로 계산하지 않고 35로 계산하여야한다. HRMS의 경우는 매우 선택적이므로 기기적인 잡음이나 시료 매트릭스에 의한 영향이 줄어들기 때문에 LRMS에 비해서 뚜렷한 피크 세기를 나타낸다.

 

2. 이온화 방법에 따른 분류

 

2.1 전자 충격 이온화법 (EI)

시료분자(M)들이 고진공 상태(10-5 Torr 이하)에서 이온 원에서 발생되는 에너지가 풍부한 전자(e-)들과 상호작용(전자 충격, 즉 EI) 해서 분자 이온을 생성하고 이들 분자 이온들 중에서 많은 부분은 더 작은 단편 이온을 생성한다. 이때 생성되는 이온들은 대부분이 양이온들이다. 분자 이온들과 토막 이온들의 집합을 질량 분석관에서 분리해서 이온 질량과 이온들의 갯수를 차트에 나타낸 것이 질량 스펙트럼이다.

 질량 분석법에서 특별한 언급이 없으면 분석물을 이온화 시키는 전자 충격 이온화법 (electron impact ionization, EI)이라 생각하면 된다. 질령 범위는 m/z 10~1,000 정도이며, 응용 분야로는 휘발성 있고 극성이 낮으며, 분자량이 작은 물질의 분석에 이용된다. 화합물의 단편 이온(fragment ion)이 생성되므로 hard ionization 방법이라 하며, 많은 단편 이온들을 이용해서 물질의 구조를 규명하는데는 유용하지만 분자이온이 나타나지 않는 경우가 있으므로 분자량 측정에는 어려운 경우도 있다.

 

2.2 화학 이온화법 (CI)

 이온 원의 압력이 약 1 Torr가 유지되도록 계속적으로 주입되는 메탄과 같은 시약 기체(reagent gas)는 시료분자에 비해서 매우 많이 존재하므로 높은 이온화 에너지에 의해서 시료분자보다 먼저 이온화 된 후 중성 메탄과의 이차 반응이 일어나서 유사 분자 이온(preudo-molecula ion 또는 quasimolecular ion)을 형성한다. 따라서, 화악 이온화법 (chemical ionization, CI)을 soft ionization 이라고 하며 화학 이온 이온화법은 화학 양이온 이온화법(positive chemical ionization, PCI)과 화학 음이온 이온화법(negative chemical ionization, NCI)이 있다. 일반적안 화학 이온화법은 PCI이고, NCI 법은 전자 친화도가 좋은 물질인 할로젠 함유 물질이나 나이트로 물질의 분석에 이용된다. 이 방법은 주로 분자 이온을 측정하는데 이용되고 휘발성 물질에 응용한다. EI와 CI는 상호보완적인 이온화 방법으로서 보통 한 이온 원에 결합되어 있어서 두 이온화 모드간의 빠른 전환이 쉽게 이루어질 수 있도록 설계되어있다.

 

2.3 고속 원자 충격법 (FAB)

 고속 원자 충격법(FAB: fast atom bombardment)도 많이 사용되고 있는 질량분석법 중의 하나이다. 이 이온화 방법에서는 고속으로 움직이는 중성 원자 살이 시료로 덮여있는 금속판을 향하게 되어있다. 원자가 지닌 많은 양의 높은 운동 에너지가 시료 분자로 전해지면서 충격을 주게된다. 이때 전해진 에너지는 여러방향으로 분산되게 되며, 이들 중 상당 부분이 시료를 이온화 시키게 된다. 충격 이온살로는 Xe나 Ar같은 rare gas를 사용한다. 이 원자들이 먼저 이온화가 된 후 그들의 운동 에너지를 증가시키기 위해서 전기장을 통과시킨다. 가속이 된 후레 고속으로 움직이는 이온들은 더 많은 기체 원자들이 들어있는 챔버 속으로 통과하게 되는데, 이 챔버 속에서 이온들과 원자들의 충돌로 인해서 전자 교환이 이루어진다. 생성된 빠른 원자들은 빠른 이온들이 원래 가지고 있던 운동 에너지를 거의 대부분 지니고서 같은 방향으로 진행한다.

시료 용액의 표면을 고속 원자들이 때리게 도면 이차적인 화학종(양이온, 음이온 및 중성)의 탈착이 일어나고, 탈착된 양이온이나 음이온들은 표면으로부터 가속되어 떨어져 나오면서질량 분석관 속으로 들어가서 질량에 따라서 분리가 이루어진다.  시료는 보통 glycerol, m-nitrobenzylic alcohol(비극성 물질에 좋음), diethanol-amine(음이온 형성에 좋음), thioglycerol [dithiolthreitol/dithioerythritol (5:1)]과 같은 비휘발성 액체 용액과 함께 섞어서 금속판 위에 적재한다. 일반적으로 FAB는 내부 에너지가 적은 분자이온 또는 유사 분자 이온을 생성하므로 토막이온이 생성되지 않아서 분자랴에 대한 정보를 얻을 수 있는 부드러운 이온화 방법이다. 기질분자는 분자 래디컬 양이온, 양이온이 첨가된 분자 이온 또는 음이온을 생성한다. 따라서 FAB는 EI나 CI로는 이온화가 되지 않는 비휘발성 물질이나 펩타이드, 당, 탄수화물, 유기 금속물 등의 열적으로 불안정한 화학물들을 포함해서 광범위한 물질들을 분석하는데 사용되며 분자량이 2,000Da까지도 측정 가능하다. 이미 다르 방법에 의해서 분리가 이루어진 물질들의 구조 확인 등에 주로 사용된다.

 

2.4 MALDI

 레이저 탈착 (laser desorption, LD)는 상당히 효과적으로 기체 이온들을 생성할 수 있다. 이 분바들간의 자발적인 반응은 시료 표면 근처의 농도가 높은 기화상(vapor phase) 지역에서 일어나며 파장을 바꿔줌으로써 선택적인 이온화가 가능하다. 이온화 방법의 특성상 비행 시간형(time-of-flight,TOF) 뷴석관리 짧은 수명의 신호를 검출하는데 주로 사용하고 있기 때문에 일반적으로 MALDI-TOF라고 한다. MALDI(matrix assisted laser desorption ionization) 방법은 촤근에 전기분무 이온화법(electrospray ionization,ESI)과 더불어 생체 분자 분석에 가장 많이 사용되는 이온화 형태이다. 예를 들어 N2, UV 레이저는 337nm에서 4ns 펄스를 발생하고, 이온 원은 25kV를 유지시킨다. 고체 시료는 적절한 매트릭스 용매에 시료를 녹인 후 용액을 휘발시켜서 만든다. 레이저 펄스는 전자적으로 매트릭스 분자를 들뜨게 하고 들뜬 매트릭스와 분석 물질의 혼합물간의 양성자 이동에 의해서 생성된 이온들을 탈착시킨다. MALDI에서 가장 일반적으로 사용되고 있는 매트릭스에는 2,5-dihydroxybenzoic acid(DHB)가 있다. 생성된 이온은 보통 양성자화된 분자, 즉 [M+H]+ 이며, 단편 이온이 아주 적게 생성되므로 분자량 측정이나 생체 고분자인 펩타이드, 단백질의 서열분석이 가능하며, 탄수화물 등과 같이 비휘발성이며, 분자량이 큰(m/z, 1,000~3,000) 물질에 응용된다.

 

2.5 대기압력 이온화법 (API)

 MALDI와 더불어 가장 많이 각광받고 있는 이온화 방법으로 전기분무 이온화법(electrospray ionization,ESI)과 대기압력 화학 이온화법(atmospheric pressure chemical ionization, APCI)이 있는데, 두 경우 모두 대기 압력 이온화법(atmospheric pressure ionization, API)이다. 시료 이온화가 대기 압력에서 이루어지면 압력이 낮은 Cl 이온화 방법에 비해서 이온화 효율이 1,000~10,000 배 크다. 전기분무는 대기압력에서 미얄의 유량으로 모세관을 통과하는 액체에 강한 전기장을 걸어줌으로써 생성된다. 전기장은 3~6kV의 전위차가 모세관과 0.3~2.0cm 정도 간격을 두고 있는 대응 전극간에 걸리게 된다. 이 전기장은 모세관의 끝 부분에 위치한 액체 표면에서 전하 축적을 유도하고 이는 높은 전하를 가진 방울들을 생성한다. 결과적으로 모세관 끝에서 아주 작은 연무 형태의 방울이 나오게 되는데, 이 과정은 분무(neubulization)라 한다. 이때 분무와 용매 증발을 돕기 위해서 질소 기체가 사용된다. 이 방울들에 포함된 용매들이 증발되면서 coulombic force가 그들의 응집력에 가까운 지점까지 수축되면서 이는 방울들의 폭발(explosion)의 원인이 된다. 궁극적으로는 폭발이 연속적으로 일어난 후 높은 전하를 띤 이온들이 탈착된다. 전기 분무에 의해 생성된 이온, 방울, 증기 등은 노즐(nozzle)과 스키머(skimmer)를 지나 질량 분석관을 통과한 후 질량 스펙트럼을 생성한다. 전지 분무 이온화 방법은 이온화 될수 있는 위치(기능기)가 없는 분자의 경우에도 다른 첨가물 생성을 통해서 이용이 가능한다. ESI 질량 스펙트럼은 fragmentation(단편화), dissociation(해리)에 의한 기여가 아닌 양성자 첨가 반응으로 부터 얻어진 다중전하 분자 이온의 통계적 분포에 해당한다. 컴퓨터 알고리즘은 ESI 스펙트럼에 있는 다중 전하 피크들을 단일 전하 피크로 전환하여 분자량을 측정하도록 개발되어 있다. ESI에서는 거대 분자로부터 다중 전하 이온(multiple charge ion)을 생성하므로 분자량이 큰 생체 고분자, 약물 등의 분자량(m/z 100~200,000)측정이 가능하므로 MS/MS 기능이 결합되면 펩타이드의 서열 분석, 단백질학, 유전체학 등에 널리 이용될 수 있다. 주로 열적으로 불안정한 물질, 분자량이 큰 물질의 분석에 널리 이용되고 있으며, 현재 대다수 LC/MS는 ESI 이온화 방법을 택하고 있다.

 또  APCI는 기체상 이온과 분자의 반응이 대기 압력에서 일어나는 이온화 방법으로서 ESI는 이온화가 용액 상에서 일어나지만 APCI는 기체상에서 이온화가 일어나는 차이점이 있다. 일차 이온들은 용매 분무 위에서 코로나 방전(corona discharge)에 의해 생성된다. 크로마토그래피에서 나온 용출물들은 기압식 분무기로 직접 들어가서 속도가 빠른 공기나 질소 빔에 의해 얇은 안개 형태로 전환된다. 방울들은 탈용매. 기회 챔버라고 하는 가열된 석영관을 통해서 기체 흐름으로 대체된다. 석영관을 떠나서 반응이 일어나는 이온 원에 도착한 뜨거운 기체와 화합물은 양성자 전달과정을 통해서 대기 압력하에서 화학적으로 이온화 되어 [M+H]+이온을 생성한다. 열 분해가 최소로 유지되며, 분석 물질의 이온화 효율은 매우 크다. 스키머에 의해서 분리된 다단계에 걸친 차등펌핑은 좋은 진공을 유지시키며 가능한 많은 이온들이 분석관으로 들어가도록 한다. 보통 APCI는 ESI로는 곤란한 열적으로 불안정한 물질이나 비휘발성 물질(당, 펩타이드, 단백질)에 적용되며, ESI와 함께 LC/MS에서 가장 많이 사용되는 이온화 방법이다.

 

2.6 유도 결합 플라즈마 (ICP)

유도 결합 플라즈마(inductively coupled plasma, ICP) 이온 원은 유도 결합에 의해 생성되는 뜨거운 불꽃으로 구성되어 있으며, 이곳으로 시료 용액이 분무형태로 주입된다. 이 이온 원은 아르곤 흐름이 통과하는 3개의 석영관으로 구성되어있다. 냉각된 유도 코일은 가장 큰 관의 상단에 둘러 감겨있다. 이 코일은 27 또는 40MHz에서 1.5와 2.5kW 사이의 전력을 발생하는 RF 발생기에 의해 동력이 공급된다. 플라스마를 유지하는 대기 압력에서 기체는 초기에 Tesla spark에 의해 전기적으로 전도되며, 흐르는 아르곤을 이온화 시킨다. 방전시에 존재하는 이온과 전자들은 코일에서 RF 전류에 의해 생성된 고주파 진공 유도장과 상호작용한다. 그들은 가속되어 아르곤 원자와 충돌하고 아르곤 원자들은 이온화 시킨다. 시료는 열적으로 생성된 증기, 작게 나누어진 에어로솔 방울 또는 미세입자 형태로 중간 석ㅇㅇ관을 통해 흐르는 아르곤에 의해서 뜨거운 플라스마 속으로 이동된다. 높은 온도는 시료를 빨리 탈용매시키고 기회시켜 시료를 원자화시킨다. 또한 높은 온도와 대기 압력 하에 있는 이 플라스마는 매우 효율적인 들뜸 장치이다. 원자들은 5,000~10,000K 온도구역에서 몇 밀로 동안 지내면서 대부분의 원소들은 단일 양전하를 딘 이온으로 이온화되며, 이온화 효율은 거의 100%에 근접한다. 이온들은 플라스마를 빠져나와 2단계 진공 펌프 인터페이스를 통과해서 질량 분석관으로 주입된다. ICP/MS는 용액 주입이 자동적으로 이루어지며, 몇분 이내에 20~30종의 원소를 측정 할 수 있다. 일반 광학 방출 분광법 ICP에 비해서 감도면에서 몇십에서 몇 백 배 정도 감도 차이가 난다. 하지만 매트릭스 방해(matrix interference)와 스펙트럼 방해(isobaric interference)가 큰 단점이다.