1. 시료, 시약 및 시액

1.1. 시료
1.1.1. 대조약: NESP
1.1.2. Darbepoetin-α 바이오시밀러

 

1.2. 시약 및 장치
1.2.1 필요 시약
  1.2.1.1. Sodium phosphate monobasic(Sigma, S8282)
  1.2.1.2. Sodium phosphate dibasic(Sigma, S7907)
  1.2.1.3. DL-Dithiothreitol(Sigma, D9779)
  1.2.1.4. Iodoacetamide(Sigma, T6508)
  1.2.1.5. N-glycosidase F(Roche Diagnostics, REF 11 365 193 001) 1.2.1.6. C4  column(Vydac, 214TP54)
  1.2.1.7. Trifluoroacetic acid(Sigma, T6508)
  1.2.1.8. Formic acid(Fluka, 06440)
  1.2.1.9. Acetonitrile(Duksan, UN1648)
  1.2.1.10. Trypsin(Roche Diagnostics, REF, 03 708 969 001)
1.2.2. 필요 기구 및 장치
  1.2.2.1. Centrifugal filter  unit(Millipore, 10,000 MWCO)
  1.2.2.2. Centrifuge(Eppendorf, 5415R)
  1.2.2.3. Centrifugal vacuum concentrator(Hanil, Ecospin 3180C)
  1.2.2.4. Heat block(Seoulin, Bio SLTDB-100)
  1.2.2.5. Agilnet HPLC 1100 series
  1.2.2.6. C4  column(Vydac, 214TP54)
  1.2.2.7. C18  column(Vydac, 218TP52)
  1.2.2.8. Accurate-mass Q-TOF LC/MS 6530(Agilent technologies)

 

 

 

 

 

2. 실험방법

 

2.1. Darbepoetin-alpha 시료로부터 염 제거(Desalting)
2.1.1. Darbepoetin-alpha 시료 50㎍을 취해 centrifugal filter unit(Millipore 사)의 filter unit에 넣고 증류수를 첨가하여 400㎕가 되도록 한 후 filtrate collection tube에 filter device을 장착한다. 2.1.2. E-tube(1.5㎖)를  수용할 수 있는 고정 각의 rotor가 부착된 centrifuge에 e-tube를 넣고 12,000rpm, 4℃에서 5분 동안 진행한다.
2.1.3. 증류수를 첨가하여 400㎕가 되도록 반복하여 교체하면서 5회 반복하여 진행한다.
2.1.4. Concentrate collection tube에 filter device를 거꾸로 장착하고 5,000rpm, 4℃
에서 30초 동안 진행하여 탈염한 시료를 회수한다.
2.1.5. Concentration collection tube의 탈염한 시료를 e-tube에 옮겨 담고 speed vac.으로 완전히 건조시킨다.    

 

2.2. 이황화 결합 환원
2.2.1. 건조한 시료를 50mM sodium  phosphate(pH 7.3) 100㎕에 녹인다.
2.2.2. 1M dithiothreitol, 5㎕를 첨가하고 잘 섞는다.
2.2.3. 미리 55℃로 설정해 놓은 heat  block에 튜브를 장착하고 30분 동안 반응시킨다.

2.3. Carbamidomethylation 반응
2.3.1. 이황화 결합 환원 반응을 마친 시료에  1M iodoacetamide, 5㎕를 첨가한다.
2.3.2. 상온에서 차광한 상태로 30분 동안 반응시킨다.

 

2.4. 탈염(Desalting)
2.4.1. Carbamidomethylation 반응시킨  시료를 취해 centrifugal filter units(Millipore 사)의 filter unit에 넣고 증류수를 첨가하여 400㎕가 되도록 하고 filtrate collection tube에 filter device을 장착한다.
2.4.2. E-tube(1.5㎖)를 수용할 수 있는 고정각의 rotor가 부착된 centrifuge에 tube를
넣고 12,000rpm, 4℃에서 5분 동안 진행한다.

2.4.3. 증류수를 첨가하여 400㎕가 되도록 반복하여 교체하면서 5회 반복한다.
2.4.4. Concentrate collection tube에 filter  device를 거꾸로 장착하고 5,000rpm, 4℃
에서 30초 동안 진행하여 탈염한 시료를 회수한다.
2.4.5. Concentration collection tube의 탈염한 시료를 e-tube에 옮겨 담고 speed vac.으로 완전히 건조시킨다.

 

2.5. PNGase F 처리
2.5.1. 건조한 시료를 50mM sodium  phosphate(pH 7.3) 100㎕에 녹인다.
2.5.2. PNGase F, 2㎕(2 IU에 해당)를 첨가한다.
2.5.3. 약 18시간 동안 37℃에서 반응시킨다.

 

2.6. 역상 고속액체크로마토그래피(RP-HPLC)
2.6.1. PNGase F를 처리한 시료에 남아 있는 PNGase F와 탈염 목적으로 역상 고속
액체크로마토그래피를 진행한다. 이때의 HPLC 조건은 다음과 같다.
   Column
     - Size: 4.6 mm × 250 mm
     - Stationary phase: Octadecyl silica gel for chromatography   R(4μm)
     - Temperature: 40℃
   Mobile Phase
     - Mobile phase A: 0.1% v/v TFA, DW     - Mobile phase B: 0.1% v/v TFA, acetonitrile

Flow rate: 0.5mL/min
   Detection: UV detector, 214nm   Injection volume: 100㎕
2.6.2. 유지 시간 약 25분에서  용출되는 피크를 e-tube에 수집한다.
2.6.3. 수집한 시료를 speed vac.으로 완전히 건조한다.

 

 

2.7. Tryptic digestion
2.7.1. 건조한 시료를 100mM ammonium bicarbonate, 100㎕에 잘 녹인다.
2.7.2. Trypsin(1㎎/㎖) 2㎕를 첨가한다.
2.7.3. 약 18시간 동안 37℃에서 반응시킨다.

 

 

 

2.8. ESI-Q-TOF MS/MS 분석
2.8.1.  Tryptic  digestion을  수행한  시료에  대해  ESI-Q-TOF  MS/MS  분석을  실시한다. 이때의 조건은 다음과 같다.

• UPLC 운용조건
   Column
   - Size: 2.1mm × 250mm
   - Stationary phase: Octadecyl silica gel for chromatography R(4μm)
   - Temperature: 40℃
   Mobile Phase
   - Mobile phase A: 0.1% v/v formic acid, DW
   - Mobile phase B: 0.1% v/v formic acid, acetonitrile
   Flow rate: 0.2mL/min
   Detection: UV detector, 214nm   Injection volume: 2㎕
• ESI-Q-TOF MS/MS 운용조건
   - Ion mode: ESI+Agilent Jet stream
   - MS range: 300～3000Da
   - Ion polarity: positive
   - Storage mode: Centroid