단백질의약품의 구조적 특성분석 (Structural Characterizationand Confirmation)

 

▷ 아미노산 서열분석 (Amino Acid Sequencing)단백질의 아미노산서열을 동정하고 상동성을 분석하여 단백질의 일차특성을 규명하는 분석법으로서, 가장 일반적인 N-말단 서열분석(N-terminal sequence determination) 방법이 사용된다. N-말단서열분석은 Edman deegraddattion 방법법에 기초하하여 여 20 pmool이상의 의 단백백질시료를 가지지고 시작한한다다. . 간혹 간혹 N--말단말단이 이 수식식화되화되어 blockiingg된 된 경우에에는특정 정 화학화학제학제나 N--말단 말단 아미아미노산 노산 분해효소를 이용하여 N-말단deblocking시키는 방법들이 개발되어 있다. C-말단 아미노산 분석은 carboxypeptidase A, B, P, Y 등을 이용하여 단백질의 C-말단 아미노산을 순차적으로 분리하여 HPLC나 MALDI-TOF를 이용하여 분석하게 된다.

 

▷ 아미노산 조성분석 (Amino Acid Compositional Analysis)단백백질이나 펩티드의 아미미노산 산 조성을 분석하는 는 방법법으로서 HCl과 같은은강산산을 을 처리하여 단백질 구성 펩티드 결합을 완전히 가수분해하여 구성아미미노산산의 의 조성성량을 을 Pico-Tag g 방법법으로 로 표준 준 20종 아미미노산노산과 과 비교하하여여RPP-HPLC로 분석한다다. . 아미미노산 산 tryptophan은 methanesulfonic acid를이용하여 별도로 가수분해하여 분석한다.

 

▷ 펩티드 맵핑 (Peptide Mapping)단백질의 전체 아미미노산 산 서열을 결정하기 위해서는 먼저 펩티드 형태로단편편화 (fragmentation)시켜야한한다다. . 펩티드 형태로 단백백질 조각을 을 만드드는방법으로는 protein diigestive enzzymee이나 chemical (CNBBr 등))을 이용하여 하여 절편편화화시화시킨다다. 다. Peptide maapping은 은 HPPLC나 FPLC를 이용하하여 여 분리리·분취한다. 각 단백질 조각들의 아미노산 서열분석은 Edmansequencing이나 MALDI-TOF를 통한 펩티드지문분석 (peptide massfiingeerprinting))이나 in--geel digeestion을 통한 tryptic digest를 분석한다.

 

▷ 이황화결합 위치 분석단백질의 3차원 구조는 단백질 내부의 cysteine-cysteine의 공유결합은은이황화화결결합 (disulfiide bond)에 의해 결정된다. . 따라라서 서 이황화화결결합 위치를결정하는 것은 단백질의 구조와 기능을 연구하는 데 매우 중요한 부분이다. 먼저 단백질을 환원제 (reducing agent)를 처리한 상태인Reducing 조건과 환원제를 처리하지 않은 Non-reducing 조건에서의peptide mapping을 실시한다다. . 먼저 단백백질을 trrypsin 처리한 trypticdiigeest를 RPP, IEX colummn n 등을 등을 이용하여 여 peptides를 정제하고고MAALDI-TOF MSS나 Edman sequencer를 이용하여 disulfide bridge(S-S) 위치를 결정한다.

 

▷ 당 분석당 (carbohydrate) 함량 량 분석은 natural sugar, amino sugar, sialicacid등을 HPLC와 MALDI-TOF를 이용하여 분석한다. 당쇄(carbohydrate chain)의 구조분석은 HPLC, MALDI-TOF를 이용하며올리리고당 당 패턴 (oligosacccharide e patttern) ) 분석석은 아미미노산산에 에 당쇄 쇄 부분의의분석으로서 antennary profile분석이라고도 한다. Polypeptide 내의당화 위치 (glycosylation site)를 결정하는 분석방법을 의미한다.▷ 기타 단백질 수식화 분석단백백질의 수식화 (post-translational modification)은 phosphorylation,amidation, acetylation 등이 있는데 주로 LTQ, MALDI-TOF-TOFMS를 이용하여 분석한다.

 

 

▣ 물리·화학적 특성분석 (Physicochemical characterization)

 

▷ 분자량 측정 : Gel permeation chromatography (HPLC,FPLC), Gel electrophoresis, Mass spectrometry

 

▷ Isoform pattern 분석 : IEF (Isoelectric focusing), CE(capillary electrophoresis)

 

▷ Electrophoretic pattern 분석 : Native PAGE, SDS-PAGE,IEF, Western blot, CE, 2D-PAGE▷ Extinction coefficient (or molar absorptivity) 분석 :UV/visible spectrophotometry, Protein content determined bytechniques- amino acid composition & nitrogendetermination (Kjeldahl analysis)

 

▷ Liquid chromatographic pattern 분석 : SEC-HPLC,RP-HPLC, IEC-HPLC, HI-HPLC, Affinity-HPLC▷ Spectroscopic profiles 분석 : UV-visible absorption spectra,Fluorescence spectra, CD (circular dichroism), NMR(higher- order structure 분석

 

▣ 면역학적 특성분석 (Immunochemical characterization)

항체의약품의 면역학적 특성을 Binding assay나 Biosensor, ELISA및 Western blotting 방법으로 분석

 

▣ 생물학적 특성분석 (Biological characterization)

 

▷ 동물기반 생물학적 적 특성 분석법 (Animal-bassed biological assays)

 

▷ 배양세양세포 기반 생물학물학적 학적 특성 특성 분석분석법 (CCeelll l cuulultuururee--bbaasseed d biioolloggiicaal al assssaayayss)

 

▷ 생화학적 분석방법 (Biochemical assays)

 

▷ Ligand/RReceptor binding assays 방법

 

 

▣ Impurity 측정 및 정제방법 (purification)

 

▷ 단백질의약품의 불순물 (Impurities of therapeutic protein) 특성분석 : 단백백질의약품품의 truncated forms (Cleavage of peptidebonds) 분석을 HPLC, SDS-PAGE, peptide mapping, N-말단,C-말단 서열분석을 통해 검증

 

▷ 단백질의약품의 변형산물 (Modified therapeutic protein) 분석 :단백질의약품의 deamidated, isomerised, mismatched S-Slinked, oxidized or altered conjugated forms을 HPLC, IEF,CE, MS, CD 방법으로 분석

 

▷ 단백질의약품의 응집체 (Aggregates of therapeutic protein) 특성분석 : 단백질의약품의 dimers 또는 higher ordered oligomers의분석은 SEC-HPLC, CE 등을 활용