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제목
[Proteomics] 아미노산 표준 분석법 -
작성자
이매스 -
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아미노산 표준 분석법
1. 개요
분석 원리아미노산은 염기성을 띠는 아미노기(-NH2)와 산성을 띠는 카르복시기(-COOH) 및유기 원자단인 R기(또는 곁가지)로 구성된 유기화합물을 말합니다..이 3가지 작용기에 따라 각 아미노산 특유의 구조가 만들어집니다. 단백질을 구성하는 주요 아미노산은 22종인데 1차 아미노산 17종, 2차 아미노산 5종으로 분류할수 있습니다. 단백질을 구성하는 주요 아미노산은 글리신 ·알라닌 ·발린 ·류신 ·이소류신 ·트레오닌 ·세린 ·시스테인 ·시스틴 ·메티오닌 ·아스파르트산 ·아스파라긴 ·글루탐산 ·디요드티로신 ·리신 ·아르기닌히스티딘 ·페닐알라닌 · 티로신 ·트립토판 ·프롤린 ·옥시프롤린의 22종이 있습니다.
2. 분석원리
1) 유도체화의필요성
일반적으로 아미노산은 single bond로 이루어져 있어 UV/VIS 파장에 대한 absorbance가없습니다. 예외적으로 tryptophane, tyrosine, phenylalanine만이 자체 UV/VIS absorbance가존재합니다. 아미노산은 형광성 물질이 아니므로, 형광 유도체화 과정이 필요합니다.
아미노산의 유도체화 reagent
- Ninhydrin
- OPA(ortho-phthalaldehyde)
- PITC(phenylisothocyanate)
- FMOC(fluorenylmethoxycarbonyl chloride)
2) 컬럼 후 유도체화 (Post columnderivatization)
양이온 교환컬럼에서 분리된 아미노산이 검출기로 들어가기 전에 반응기에 유도체화 시약을넣어 주어 on-line으로 유도체를 만들어 검출하는 방법.
3) Ninhydrin
유리아미노산을 양이온 교환 컬럼으로 분리한 후 Ninhydrin과 반응시켜 UV/VIS 검출기로검출하는 방법입니다. . Ninhydrin법의 경우 1차, 2차 아미노산 모두에 대해 유도체화가가능하며, 1차 아미노산의 경우 130℃에서 Ninhydrin 시약과 반응하여 Hydrindantin 을거쳐서 570nm, 405nm에서 최대 흡광도를 갖는 보라색의 반응물이 생성됩니다.
4) OPA
유리아미노산을 양이온 교환 컬럼으로 분리한 후 OPA와 반응시켜 형광검출기로 검출하는 방법입니다. . OPA법의 경우 1차 아미노산에 대하여 유도체화가 가능하며, Ninhydrin법과는 달리상온에서 OPA시약 및 Thiofluor와 반응하여 형광을 띄는 Isoindole이 생성됩니다.따라서 OPA법의 경우는 형광검출기를 이용하여 검출합니다.
분석방법
1) 시료의 전처리
시료의 양을 결정한다 (예. 간장 200mg을 vail에 넣는다)6N HCl 30ml를 vail에 넣고 130도에서 24시간동안 가수분해 한다..가수분해가 끝난 시료에 초순수로 50ml가 되도록 희석한다0.45um 수용성 syringe filter로 filtering 한다가수분해 된 시료 20ul와 diluent(or 20ml HCl)20ul로 섞는다
2) 분석조건
UV/Vis detector 파장(Ninhydrin 시약) : 1, 2차 아미노산 405nm
Fluorescence 파장(OPA 시약) : Ex 330nm, Em 465nm
Column : Cation column