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[HPLC] HPLC 에서 사용되는 검출장치

 
검출장치
이동상에 있는 용질들이 칼럼에 의해 분리되고 분리된 성분들을 감응하는데 사용되는 장치가 검출기이다. 이상적인 HPLC 검출기는 고감도, 범용검출 감응이나 특이 감응, 넓은 선형적 범위, 칼럼 외 부티에 의한 띠 넓힘이 없거나 최소화 그리고 온도 또는 흐름 속도 변화에 대해 안정한 감응을 나타내는 특징을 가져야한다. 이러한 모든 요건을 가지고 있는 검출기는 없지만 그들에 가까운 특성을 가지고 있는 검출기는 있다. 검출기들은 범용감응 검툴기(용액 성질 검출기)와 선택성 검출기(용질 성질 검출기)의 두 종류로 나눌 수 있다. 범용 감응 검출기는 이동상 용액의 물리적 성질들을 측정하는 것으로 굴절률, 전기 전도도, 광산란 그리고 열흡수 검출기들이 이 범주에 속한다. 후자의 검출기는 이동상 용매의 성질이 아니고 용질들만의 물리적 성질들을 특정하는 것으로 자외선-가시광선(UV-Vis), 적외선, 형광 및 원자 흡수 분광기 그리고 전기양과 전류법 및 방사법 검출기들이다. 또란 질량 분석(MS) 검출기는 선택성이나 범검출용으로서 매우 유용한 검출기이다.
 
1. 광학 검출기
 
1) 자외선-가시선 검출기
가장 많이 활용되는 HPLC 검출기는 자외선-가시선 분광계로 많은 유기 화합물들이 자외선-가시선 영역에서 일반적으로 흡수띠를 가지고 있다(이런 화학물들의 화학 구조를 발색단이라고 함). 자외선-가시선 검출기는 이동상의 흐름 속와 온도 변화에 검출 감응의 변화가 없고 수 ng이하를 검출한다. 그러나 이러한 종류의 검출기는 자외선-가시선 영역에서 흡수띠가 없는 용질들은 검출되지 않는다. 이러한 검출기로 검출하려면 용질들을 칼럼 전 유도체화 또는 칼럼 후 유도체화 시켜서 발색단이 있는 화학구조로 변화시키면 검출 할 수 있다. 용리 후 칼럼 유도체화로 새이는 띠 넓힘을 피하려면 HPLC 장치는 특수하게 만들어져야 한다. 자외선-가시선 검출기에 널리 사용되는 흐름 용기(flow cell)의 부피는 8ul 또는 그 이하이고 통로 길이는 10mm이나, 내경이 4.6mm인 HPLC 칼럼보다 작은 microbore 칼럼에서는 0.1~0.3ul의 용기 부피가 사용되어야 한다.
 
2) 형광 검출기
화합물중에는 자외선이나 가시선의 에너지를 흡수하면 형광이 방출되는것들이 있다. 분자의 전자 에너지가 들뜬 다음에 바닥 상태로 자연 붕괴되는 과정에서 보다 더 킨 파장의 복사선을 방출한다. 이러한 현상은 매우 특이해서 매우 높은 감도와 선택성을 가지고 검출할 수 있게한다. 일반적으로 수은이나 제논 램프가 들뜬 복사선 광원으로 사용되고 있으며, 전형적인 형광분광형 검출기는 광원에서 나온 복사선이 필터를 경유해서 시료 용기로 들어간다. 시료에 입사된 일정 파장의 복사선을 들뜸 하장이라고 한다. 입사광의 직각방향으로 시료 용기로부터 보다 긴 파장의 전자기 복사선이 방출된다(방출 또는 형광 파장이라고 함) 이 방출광은 필터를 거쳐 광다이오드 검출기에서 감응한다. 형광 소광을 할 수 있는 부적절한 용매나 이동상내에 산소가 없도록 주의해야한다. 이 검출기의 검출한계는 자외 복사선 검출기보다 10~100배 좋다. 칼럼전과 칼럼 후 유도체를 사용하여 형광이 없는 화합물의 분석에 종종 사용된다.
 
3) 증기광산란 검출기
증기 광산란 검출기에서는 이동상이 증발된 비휘발성 분석물 입자에 복사선을 투과할 때에 입사 복사선과 같은 주파수의 복사선이 용질들의 전지적 쌍극자를 유도한다, 이렇게 유도된 쌍극자는 전자기 복사선을 방출하며, 이를 광산란이라고 한다, 90도 방향에서 검출된 산란광의 세기는 농도가 같은 용질들마다  같은 검출 감응을 나타내는 범용검출기로써 굴절률 검출기보다 감도가 좋다. 레이저에서 발생하는 낮은 각의 산란광은 분자량 특정이 가능해서 크기배제크로마토그래에서 고분자 물질들을 검출하는데에 적합하다. 흐름 용기를 투과한 복사선은 복사선 수집기,반사거울, 복사선 필터 및 산란 판을 경유해서 광전 증배관에서 전기적 신호를 얻는다. 휘발성 분석물질은 증발 과정에서 손실이 일어나 정량분석이 어렵다.
 
4) 굴절률 검출기
굴절률 검출기는 이동상 용매와 이동상 용액에 분석물이 존재함으로써 생기는 굴절률의 차이를 검출한다. 굴절계는 원리가 다른 세 가지 종류로서 광학 반사, 광학 굴절과 간섭계가 있다. 모든 화합물들이 다른 굴절률값을 가지고 있기 때문에범용 검출기이다. 그러나 이 검출기는 농도 변화에 따른 감응의 직선성이 넓지만, 자외 복사선 검출기보다 100배 정도 낮은 감도를 가지고 있다. RI 검출기는 압력과 온도 변화에 민감해서 항온이 필요하고 펄스없는 펌프를 부착해야한다. 이 검출기는 용리액의 조성변화에 따라 굴절값이 변하게 되어 감응이 다르게 나타나므로 기울기 용매 기법은 적절하지 않다. 또한 시료의 굴절률 값이 용리액의 값보다 크면 바탕선상에서 (+)봉우리가 나타나고, 두 값이 작으면 (-) 봉우리가 된다.
 
 
 
 
 
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