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[HPLC] HPLC 분석 시 Retention time이 변화하는 경우, 분석 시 column 온도의 중요성

◆ Retention time이 변할 경우
 
 1. RT가 길어지는 경우 
이동상의 flow rate가 늦어지는 경우에 발생합니다. Flow가 늦어지는 이유는 다음과 같은 문제를 확인해 보아야 합니다.
 
1) bubble : 이동상에 기포가 생기면 단위시간당 흐르는 유량의 감소로 RT가 늦어질 수 있습니다. Online degasser를 사용하는 경우 이런 문제를 효과적으로 예방할 수 있습니다.
 
2) check valve : 이것은 펌프 피스톤으로 들어오는 이동상과 나가는 이동상의 역류를 방지하기 위한 것으로 이 부분에 작은 이물질이 끼거나 고장이 나면 leak가 생기게 됩니다. 이럴 경우 청소나 교환이 필요합니다. 이런 문제는 이동상의 filtering 미비로 인한 이물질의 혼입, pump seal의 손상으로 인한 이물질 발생, buffer 이동상을 사용하고 난 후 washing의 불완전으로 인한 염의 침전 등으로 발생합니다.
 
3) pump seal : 펌프 피스톤을 감싸고 있으며, 주기적인 소모품으로 제조회사마다 수명이 정해져 있습니다. 수명의 75%되는 시점에서 교환하는 것이 좋습니다. 
 
4) leak : 컬럼연결 부위나 기타 연결 부위에서 이동상이 새게 되면 RT가 길어집니다. 모든 연결부위를 점검합니다.
 
 
2. RT가 흔들리는 경우
 
1) 컬럼온도 변화 : 컬럼온도가 1도 변할 때 마다 RT는 1~3% 움직일 수 있습니다. 컬럼오븐 사용을 강력히 권장합니다.
 
2) 이동상 : 휘발성이 높은 이동상이 사용되는 경우 실험을 진행하면서 이동상이 휘발하게 되면 RT가 변할 수 있습니다. 그러나 완전히 이동상 용기를 밀폐하는 경우 이동상을 사용함에따라 이동상 용기에 진공이 발생할 수 있습니다. Vent를 할 수 있는 최소한의 통로는 남겨 놓아야 합니다. 또 한가지 주의할 점은 이동상의 pH입니다. Buffer의 pH가 buffer pKa의  ±1이내에 있어야 유효합니다. 
 
3) 컬럼노후로 인해 RT가 변할 수 있습니다. Reverse phase 컬럼의 경우 노후화가 진행되면 active site의 감소로 인해 RT가 빨라지는 경향이 있습니다. 
 
4)  low  pressure  mixing  pump의  경우  proportioning  valve의  불안정이  RT의  흔들림을 초래할 수 있습니다.
 
 
◆ 분석 시 column 온도의 중요성
 
1. RT에 미치는 영향 : 일반적인 실험실의 경우 아침저녁으로 5℃의 온도차가 날 수 있으면 특히 계절적 요인이 있는 곳에서 흔히 경험할 수 있습니다. 일반적으로 1℃의 온도변화는 1%의 retention time의 변화를 가져올 수 있다고 합니다. 이러한 자료를 토대로 한다면 overnight하는 실험의 경우 온도가 4℃ 정도 떨어지는 경우가 발생하면 15분 근처에 나오는 피크는 software에서 standard matching에 실패를 가져올 수도 있습니다.
 
2. 선택성에 미치는 영향 : 컬럼 온도가 현저하게 변하는 경우 특정 물질의 선택성의 변화가 심하여 peak의 elution order가 바뀌는 일이 있을 수 있습니다. 선택성이 변화를 막고자 한다면 컬럼 온도를 일정하게 조절하는 것이 현명한 방법입니다.
 
3.  피크  모양에  미치는  영향 : 컬럼의 preheating이 없는 oven의 경우 피크모양의 왜곡이 더 심해질 수 있습니다. 이는 컬럼의 외부는 온도가 높고 안쪽은 낮으며, 이동상이 들어가는 column inlet 부분은 낮고 column outlet으로 나오는 부분은 온도가 높기 때문입니다. 이럴 경우 컬럼 바깥쪽으로 진행하는 물질의 경우 평형상태가 빠르지만 안쪽은 느리게 되어 피크가 더 broad해 집니다. 특히 컬럼 온도를 setting한 것보다 컬럼내부의 실제 온도는 더 낮게 되므로 RT또한 커지게 됩니다. 
 
4. 요약 : 위와 같은 문제가 생기지 않도록 하기 위해서는 이동상을 반드시 pre-heating하는 것이 필요합니다. 특히 유속이 빠른 실험에서는 이런 이동상의 온도 차가 더 크게 되므로 더 필요성이 커진다고 할 수 있습니다.
 
 
 
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