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제목
[HPLC] HPLC 장비에서의 압력(pressure)의 중요성 -
작성자
이매스 -
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HPLC 장비에서의 pressure 의 중요성
HPLC 장비를 쓰다 보면 한 가지 궁금한 점이 왜 압력을 항상 display 창에
실시간 pressure 를 모니터링을 하는 점이 아닐까요? 그렇다면 압력 pressure 의 변화는 기기의 상태에서 중요한 비중을 차지한다는 점을 감안할 수 있습니다.
따라서 본 자료는 이 pressure 가 갖는 의미는 어떤 것이 있는지 소개하는 내용을 구성되어 있습니다.
1. 압력(pressure)의 의미
HPLC 에서는 압력을 생성하는 원인은 solvent 가 HPLC 하드웨어 각 모듈을
통과할 때 각 부분에 setting 된 tubing를 통과할 때의 저항 값이라고 이해하시면
됩니다.
그 중에서 column 도 엄밀히 얘기하면 또 다른 형태의 tube 라고 할 수 있습니다.
따라서 이 압력의 변화를 기기의 상태(status) 및 시료의 분석 상태를 나타내는 중요 지표가 될 수 있는 것입니다.
2. 압력(pressure)이 발생되는 순서 또는 위치
기본적으로 용매가 처음 들어가는 시점부터 최종 배출되는 시점까지를 하드웨어가 구성된 순서대로 이해하시면 됩니다.
1) pump
- check valve
- cylinder
- mixer
- tubing
2) Injector
3) Column
4) Detector
5) Fraction collector
6) Backpressure regulator
( 5) 6) 은 선택항목입니다.)
3. column 의 압력 확인
우선, column 을 연결하기 전의 각 hardware 를 연결된 조건에서
일정 유속의 solvent 가 흐를 때의 압력을 의미하며,
이 조건에서 column 을 연결 시 증가된 압력이 column에 의해 생성된 압력입니다.
4. Leak 또는 blockage 의 확인
2 항에서 solvent 가 흐르는 순서를 역으로 하나 하나를 순서대로 제거하면서
압력의 변화를 체크합니다.
1) Backpressure regulator - Detector
detector 의 inlet line 을 분리 했을 때 와 다시 결합했을 때 압력의 변화를 관찰합니다.
만약, 결합 후 동일 유속 조건에서 이전에 정상압력 보다 낮은 경우 두 모듈 사이의
leak 를 의심하고 확인해야 합니다.
만약, 다시 결합했을 시 압력이 정상압력보다 높은 경우에는 detector 내부의 cell 과 그 사이의 tubing의 blockage를 의심하고 새 tube 로 교체를 합니다.
2) Detector - Column - Injector
HPLC 에서 가장 주요 압력이 생성되는 곳입니다.
우선, column 의 outlet line 을 분리/재결합을 반복하면서 압력의 변화를 확인합니다.
만약, 결합 후 동일 유속 조건에서 이전에 정상압력 보다 낮은 경우 두 모듈 사이의
leak 를 의심하고 tubing 사이의 fitting 상태를 재확인합니다.
만약, 다시 결합했을 시 압력이 정상압력보다 높은 경우에는 cell 과 그 사이의 tubing의
blockage 를 의심하거나 detector cell 부분이 막힌 경우를 의심합니다.
column 을 분리/재결합 시 압력이 정상압력보다 낮은 조건을 유지한다면 당연히 column outlet line 의
leak 를 의심하면 되고 그 부분이 문제가 아니라면 injector 부분의 leak 를 체크합니다.
column 을 분리 시에도 압력이 계속 상승 할 때에는 tubing 이 막힌 것이 확실합니다. 따라서, 새 tube 로 교체하셔야 합니다.
몇일/몇주 시간 간격에서 같은 용매 조건, 유속 조건에서 column 을 연결했을 때, 압력이 낮은 비율로 상승한다면 column aging 을 생각하면 되고 chromatogram 에서의 peak resolution 을 함께 고려하여 교체 여부를 판단하시면 됩니다.
3) Injector 에서 압력의 변화
Injector 부분은 대부분 injector seal 이 마모되어 나타나는 leak 현상으로 압력에 대한 curve 를 확인 시 load/inject position 변화 시 baseline 에 noise peak 형태의 변화가 심하게 나타나면 교체를 해주어야 합니다.
4) Mixer 부분의 압력변화
Mixer 의 압력변화는 항상 solvent 의 교환이 일어나는 장소이므로 solvent 에서 기인된
오염 물질이 축적되어 pre-filter 부분이 막히면 압력이 증가하게 됩니다.
따라서 이때에는 filter 교환을 해주시면 됩니다.
5. Solvent 에 따른 압력 변화
일반적으로 reverse phase column 을 사용하는 경우 용매의 극성(polarity) 에 따라
압력에 대한 변화가 다르게 나타납니다.
- 극성 용매 : 일반적으로 압력이 상승합니다.
- 비극성 용매 : 일반적으로 압력이 감소합니다.
따라서 이 두 용매의 섞인 비율에 따라 특정 압력 값이 지속적으로 유지 또는 변화를 하게 됩니다.
만약, 이전에 A 용매는 물 B 용매가 acetonitrile 의 경우 B 는 비극성 용매 이므로 A 용매 100% 조건의
압력에 비하여 B 용매의 함량이 증가될수록 압력이 감소되는 패턴을 보입니다.
반대로 B 용매가 MeOH 과 같은 극성 용매의 경우 A 용매 100% 조건 일 때의
압력에 비하여 B 용매의 함량이 증가될수록 압력이 증가되는 패턴을 보입니다.
또한, column 이 equilibrium 이 된 상태에서는 압력이 일정한 값이 지속적으로 보여지나
용매의 조건이 column 내에서 변하는 경우 증가 또는 감소되는 curve 를 그리는 패턴이 나타납니다.