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◄ 단백질 분석과 관련자 FAQ ►

Q1) 재조합 단백질의 발현이 성공했는지 확인하고 싶을 때는 어떤 분석이 보다 효율적일까요?
 
A) N 말단 서열 분석(Edman Sequencing Analysis) 입니다.
단백질 발현 확인의 screening 은 전체 서열 확인이 필요하지 않고 5~10mer 내외에서 확인 후 예상서열(reference sequence)와 비교 분석을 하시면 됩니다.
 
Q2) 천연의 단백질(펩티드)의 identification 을 진행하고 싶다면 어떤 분석이 적절한 선택일까요?
 
A) Human 과 같은 고등생물 /Aradopsis 와 같은 식물의 연구모델군/Drosophila 와 같은 곤충의 연구모델군/ 미생물(대장균..)군인 경우 peptide mass fingerprinting 법을 통하여 identification 이 보다 높은 성공률을 나타냅니다.
위에서 열거되지 않은 생물 군의 경우, 1차 분석은 Edman Sequencing 그리고 2차 선택적으로 peptide mass fingerprinting 법을 이용한 분석을 통해 보다 완벽한 identification 수행 할 수 있습니다.
 
Q3) 단백질의 예상 서열은 알고 있는 조건에서 N-, C- 말단에서 truncation/ modification 현상이 일어났는지 알아보는 적절한 분석 접근 방법은?
 
A) 단백질의 N 말단 부분만의 truncation 을 확인하고 싶을 때에는 Edman Sequencing 분석을 통해 5mer 미만으로 분석해도 정확한 정보의 확인이 가능합니다.
단백질의 truncation 의 정보가 전혀 없는 경우에는 peptide mapping 을 수행하여 예상되는 N-, C-term peptide fragment 를 확인하고 없는 경우 m/z 값이 unmatched peak 값을 MS/MS 분석을 진행하여 확인하는 방법입니다.
 
Q4) 재조합 단백질의 전체 아미노산 서열을 확인하고 싶은 경우 어떤 분석방법이 적절 할까요?
 
A) Peptide mapping 분석을 통한 서열 분석을 권장합니다. 부가적으로 단백질의 분자량, 서열특성에 따라 trypsin 에 의한 sequence 확인 효율이 낮은 경우 multi-enzymatic digestion 을 통한 mapping 을 수행하여 98% 이상의 효율을 기대할 수 있습니다.
참고로 N-term 부분의 불완전한 sequencing 정보만 획득된 경우, 부가적으로 Edman Sequencing 을 수행하여 확인하는 방법도 권장됩니다. 참고로 protease 선택은 일반적으로 cleavage site 가 되는 아미노산 잔기 뒤에 이어서 Proline 이 위치한 경우 적절하게 cleavage 가 일어나지 않을 수 있습니다. 이런 경우 적절한 위치가 cleavage 가 가능한 protease 선택이 중요합니다.
 
Q5) 재조합 단백질의 아미노산 서열 이외에 단백질의 순도, disulfide-bond determination, impurity 의 ID 를 복합적으로 수행하고 싶다면?
 
A) Peptide mapping 분석을 통한 서열 분석을 권장합니다.
본 시료의 기본적인 전처리 방법을 시작으로 다양하게 N-term, C-term, internal sequencing 이외에 disulfide-bond determination 과 impurity protein의 ID 등이 복합적인 접근이 가능합니다.
 
Q6) 합성펩티드의 전체 서열을 확인하고 싶다면 ?
 
A) Edman Sequencing 분석법의 경우 시료로부터 직접 서열을 결정하는 방식으로 tight 하게 화학반응이 control 되는 분석으로 chromatogram 인 데이터의 비교 분석을 통하여 서열을 결정하는 데이터 분석이 쉬운 장점이 있습니다.
한편, modified amino acid 가 포함된 펩티드의 경우에는 MS/MS sequencing 을 통한 분석을 권장합니다. 단, Leu/Ile 의 구분이 중요한 경우에는 ms/ms fragmentation 의 mechanism 에 따라 가능여부가 결정되므로 이때에는 Edman Sequencing 을 권장합니다.
 
Q7) 정확한 De Novo Sequencing 을 수행하고 싶다면 ?
 
A) Intact 한 단백질이 상태서는 Edman Sequencing 분석을 통한 N 말단 서열 분석이 신속 정확하며, internal sequencing 은 peptide mapping 을 HPLC (RP C18 column)을 통하여 separation 울 한 다음 분리된 펩티드를 Edman Sequencing 또는 MS/MS sequencing 을 통하여 확인한다.
 
Q8) 단백질이나 펩티드에 non-peptide 성 물질의 tagging 을 confirm 하고 싶다면 ?
 
- PEGylation (at C-term ) :
1st : Edman Sequencing 을 통한 N 말단 서열의 open 확인
2nd : conjugated peptide 에 single protease 처리  peptide, PEG 의 분자량 확인
 
- PEGylation (at N-term ) :
1st : conjugated peptide 에 single protease 처리  peptide, PEG 의 분자량 확인
2nd : 펩티드만을 ZipTip C18 으로 분리 후 - Edman Sequencing 수행 : 예상 서열과 일치 확인
 
- Dye conjugated in peptide :
1st : 합성 전, 펩티드, 형광물질의 intact MW 측정
2nd : 합성 후, conjugate 의 intact MW 결정
3rd : conjugation site 확인이 필요한 경우 Edman Sequencing 을 통하여 확인
 
코멘트 1
  • 문욱열 2017-09-18 13:22:43

    * 비밀글 입니다.