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단백질 I.D. 를 위한 In Gel Digestion 방법

In Gel Digestion Condition (from Acrylamide gel) >
q Wash buffer : 50% acetonitrile + 100mM NH4HCO3NH4HCO3(ammoniumbicabonate) Mw 79.056g/mol ? 79.05mg/ml
q10mM DTT : 1M DTT 10㎕ ( 154.2mg/ml) + 100mM NH4HCO3 990
q 0.025㎍/㎕ trypsin : trypsin 25㎕(0.1㎍/㎕ (0.1mg/ml) stock) + 100mM NH4HCO3 75
q 55mM IAA (10.2mg/ml)
q 0.1% TFA 50% ACN
 
 
 
1. Gel에서 protein band를 확인한 뒤, 칼을 이용하여 gel을 잘게 자른뒤 1.5ml tube에 넣는다.
(1~2ug protein 이면 충분)
2. 각 Tube에 wash buffer 150㎕를 넣는다.
3. 호일로 tube를 감싸준 뒤, 37℃ shaking incubator에서 5분간 incubation한다.
4. Wash buffer를 제거한 후, 새로운 wash buffer를 넣어준 뒤 5분간 incubation. (dye가 완전히 빠질 때까지    이 과정을 반복해 준다.)
5. Dye가 완전히 빠지면 wash buffer를 제거한 후 speed vac. 에서 10min간 말린다.
6. 마른 sample에 10mM DTT 30㎕을 넣어준 뒤, 호일에 싸서 57℃에서 40분간 incubation.
7. Tube내 DTT를 제거한 후, 55mM IAA를 30㎕ 넣어준 뒤, 호일로 tube를 싼 뒤 상온에서30분간
   incubation.
8. Tube내의 IAA를 제거한 후, wash buffer 150㎕를 넣어 준 후, 호일로 싸서 37℃ shaking
   incubator에서 5분간 incubation.
9. Tube내의 wash buffer를 제거한 후, speed vac.에서 30분간 말린다.
10. 말린 gel에 trypsin(0.025㎍/㎕)을 20㎕를 넣고 overnight.
11. 0.1% TFA in 50% ACN solution 을 이용하여 generated peptide 를 추출한다.
12. Speed Vac. 을 통하여 dry 를 한다.
13. MALDI-TOF Ms 분석을 수행한다.
 
3.gif

 

 
<PVDF Digestion Conditions>
MeOH
100mM Tris (or 100mM NH4CO3 , 79.05mg/ml)
45mM DTT (6.9mg/ml)
100mM Iodoacetoamide (18.46mg/ml)
1% RTX-100 digestion buffer (hydrogenated Triton X-100, Octyl glucopyranoside) or 100mM
NH4CO3 ,
Enzyme (0.1 μg/μl) solution
WEAR GLOVES DURING ALL STEPS
1) Cut wet PVDF into 1 X 1 mm pieces and place into a CLEAN 1.5 ml tube.
2) Wet membrane with a few μl’s of methanol.
3) Add 100 μl of 100 mM Tris, pH 8.0(NH4CO3).
4) Add 5 μl of 45 mM DTT, 30 min @ 55°C.
5) Add 5 μl of 100 mM Iodoacetamide, 30 min @ room temperature, in dark.
6) Discard reduction/alkylation buffer.
7) Add 50-100 μl of 1% RTX-100 digestion buffer.
8) Add 5 μl of enzyme (0.1 μg/μl), incubate @37°C, overnight.
9) Remove supernatant (save!) and extract
10) remaining peptides with first 50 μl of fresh digestion buffer then 100 μl of 2% TFA.
11) Inject all (~200 μl) onto HPLC. (Sepak C18 cartrige - Desalting)
12) Speed vac. 을 하여 dry 한 후, 50% ACN 으로 dissolve 하여 MALDI-TOF 분석에 spotting 하여 사용한다.

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