A~B.의 O-glycan 전처리 과정 후에는 회수된 당사슬은 두 개의 tube에 나눠 SpeedVac을 이용하여 건조한 후 2-AB labeling과 permethylation을 각각 수행하여 HPLC 및 MS 분석이 동시에 가능합니다.

C의 과정은 미량의 당단백질 시료를 사용하여 분석이 가능하고 편리성이 뛰어나다는 장점이 있으나, HPLC 분석은 할 수 없다는 단점이 있습니다. 따라서, MALDI-TOF MS 분석을 수행할 때 효율적인 전처리 방법입니다.

A. Ammonia β-Elimination을 이용한 O-glycan 전처리법 (Huang et al., 2001 참고)

1. 28%의 aqueous ammonium hydroxide(NH4OH) 500㎕에 50㎎의 ammonium carbonate((NH4)2CO3)를 녹인다.

2. solution을 건조된 100㎍ fetuin이 들어있는 screw cap vial에 넣고 여러 번 invert하여 녹인다.

3. 3. 2.에 다시 50㎎의 ammonium carbonate를 넣어 60℃에 6시간 incubation 한다.

4. 반응이 끝난 fetuin은 SpeedVac을 이용하여 상등액을 상온에서 건조 한다.

5. Ammonia을 휘발시키기 위해 water로 pellet을 풀어준 후 다시 건조한다. (4회 반복)

6. 건조된 시료에 0.5M boric acid 100㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 incubation한다.

7. 100㎕ MeOH를 첨가 한 후 건조한다. (4회 반복)

8. 회수된 당사슬은 두 개의 tube에 나눠 SpeedVac을 이용하여 건조한다.

B. Modified Ammonia β-Elimination을 이용한 O-glycan 전처리법(Miura et al., 2010 참고)

1. 당단백질 20㎕ (1~400㎍)에 30㎎ ammonium carbamate를 넣어 60℃에서 20시간 반응한다.

2. 반응이 끝나면 500㎕ 정제수를 넣고 60℃에서 SpeedVac(chamber temp. 60℃)을 이용하여 건조한다.

3. 500㎕ 150mM acetic acid를 첨가하여 녹인 후 다시 건조하기를 반복한다.

4. 회수된 당사슬은 두 개의 tube에 나눠 SpeedVac을 이용하여 건조한다.

C. Enzyme/Chemical을 이용한 O-glycan 전처리법(Miura et al., 2010 참고)

1. 당 단백질 20㎍에 50 mM ammonium bicarbonate buffer를 넣고 1㎎/㎖ Pronase를 단백질 농도의 10%가 되게 첨가한다.

2. 40℃ 48시간 incubation하여 당단백질을 digestion 한다.

3. 반응이 끝나면 SpeedVac을 이용하여 건조한 후 solid-phase permethylation을 수행한다.