Glycan modification 방법 중 methylation은 산성 당사슬을 분석하는 가장 일반적인 방법입니다.

다음은 당단백질에서의 glycan 분리/정제 후 Methylation을 통해 산성당을 중성 당사슬로 변환시키면, 질량분석 시 분해능과 민감도가 높은 Positive mode로 분석이 가능해지는 장점이 있습니다.

A. Solid-phase permethylation을 이용한 MALDI-TOF 분석시험법

다른 permethylation 방법 중 분석 효율(감도)이 가장 높은 전처리 방법입니다.(식약처 가이드라인, 2012)

1. 사용 직전에 ACN에 담가 둔 NaOH bead를 micro spin column에 3cm 가량 packing 한다.

2. Column에 2㎖ tube를 끼워 100g에서 2분간 원심분리하여 ACN을 제거한다.(원심분리기에 따라 회전수와 수치는 다를 수 있음)

3. DMSO 150㎕를 column에 넣고 원심분리하여 씻어주기를 2회 반복한다.

4. 분리하여 건조된 당사슬 시료에 DMSO 90㎕, water 2.7㎕, iodomethane 35㎕를 넣고 섞는다.

5. 새로운 2㎖ tube를 끼운 NaOH bead가 들어있는 spin column에 '4.'에 해당하는 시료를 흘려준다.

6. 400×g에서 1분간 원심분리하여 flow through를 회수한다.

7. 회수된 flow through를 다시 column에 넣고 400×g에서 1분 간 원심분리 한다. (8회 반복)

8. 마지막으로 column에 ACN 150㎕를 넣고 400×g에서 1분간 원심분리하여 flow through를 회수한다.

9. 모두 모아진 flow through에 chloroform 400㎕, 500 mM NaCl 1㎖을 첨가하여 shaking 후 200g에서 1분간 원심분리하여 상등액을 제거한다.

10. 500mM NaCl 1㎖을 다시 넣고 shaking 후 원심분리하여 chloroform을 제외한 상등액을 완전히 제거한다.

11. Permethylation되어 당사슬이 용해되어 있는 chloroform은 SpeedVac을 이용하여 건조한다.

B. Methylesterification을 이용한 MALDI-TOF 분석시험법

Soluble 형태로 조작이 간편하며 쉽고 빠르게 modification 할 수 있다는 장점이 있습니다.(식약처 가이드라인, 2012)

1. 건조된 당사슬에 50㎕ anhydrous DMSO와 10㎕ iodomethane을 넣고 vortexing과 함께 잘 섞어준다.

2. 상온에서 2시간 방치 한다.(시료에 따라 노란색을 띌 수 있음)

3. 100㎕ anhydrous DMSO를 넣고 잘 섞어 준다.

4. SpeedVac을 이용해 건조 시켜 준다.

5. H2O 또는 methanol에 용해시켜 준비 한다.