α-1,3-fucose의 존재로 일반적으로 Mammalian 및 Yeast 유래의 당단백질을 처리 시 사용하는 PNGase F로 N-glycan을 유리시킬 수 없습니다. 해당 과정은 PNGase A를 이용한 식물 및 곤충 유래의 당단백질에서의 N-glycan을 분리/정제하기 위한 전처리 과정입니다. 다음의 전처리 과정을 완료한 후에는 Native N-glycan을 회수할 수 있으며, 활용하려는 분석 목적 및 기기에 맞추어 별도의 유도체화 과정(2-AB labeling, Solid-phase permethylation 등)이 필요합니다.

A. 당단백질로부터 N-glycan 분리

1. 시료 50㎍을 tube에 넣고 100mM HCl (pH2.2, 10X)를 첨가하여 섞는다.

2. 100℃ heat block에서 5분 동안 반응하여 당단백질을 denaturing 시킨다.

3. 상온에서 식힌 후, 최종 volume에 맞춰 정제수와 Pepsin(0.1㎎/㎖) 1㎕를 첨가하여 충분히 섞어준다.

4. 37℃ heat block에서 12시간 동안 반응한다.

5. Pepsin 1㎕를 한번 더 첨가하고 37℃ heat block에서 12시간 동안 반응한다.

6. 100℃ heat block에서 5분 동안 반응하여 pepsin 반응을 stop시킨다.

7. SpeedVac을 이용해 건조 하여 반응 buffer를 모두 날려준다.

8. 건조된 시료에 1M sodium acetate (pH5.0)을 첨가 하고 PNGase A(Roche 제품 사용) 1mU을 첨가하여 충분히 섞어준다.

9. 37℃ heat block에서 16시간 동안 반응한다.

B. GC(Graphitized Carbon) column을 이용한 절단된 N-glycan 회수

10. 0.1% TFA가 포함된 80% ACN 10㎖을 흘려 column을 activation 시킨다.

11. 정제수를 10㎖을 흘려준다.

12. PNGase F 효소를 이용하여 N-glycan 분리가 끝난 시료를 GC column에 흘려준다.

13. 정제수 10㎖을 흘려 column에 부착된 당사슬을 제외한 단백질들을 제거 한다.

14. 0.075% TFA가 포함된 25% ACN 1㎖을 흘려 N-glycan을 회수 한다.

15. 회수된 당사슬은 SpeedVac을 이용하여 건조한다.

※ 참고 ※

◆ 식물 또는 곤충 유래 당단백질의 당사슬 구조 분석 시 PNGase A를 이용한 N-glycan 분리를 수행 합니다.

◆ 건조된 당사슬은 -20℃에 보관하여 한 달 이상 사용 가능 합니다.