Mammalian 및 Yeast 유래의 당단백질로부터 N-glycan 분리에 효율적인 PNGase F 효소를 이용한 일반적인 N-glycan 분리/정제 과정입니다.

다음의 전처리 과정을 완료한 후에는 Native N-glycan을 회수할 수 있으며, 활용하려는 분석 목적 및 기기에 맞추어 별도의 유도체화 과정(2-AA/2-AB labeling, Methylation 등)이 필요 합니다.

A. 당단백질로부터 N-glycan 분리

1. 시료 50㎍을 tube에 넣고 PNGase F(65 unit, NEB)에 동봉된 denaturing buffer(10x)를 첨가하여 섞는다.

2. 100℃ heat block에서 5분 동안 반응하여 당단백질을 denaturing 시킨다.

3. 상온에서 식힌 후, 최종 volume에 맞춰 정제수와 G7 reaction buffer(10x), NP-40(100x)를 첨가하여 충분히 섞어주고 PNGase F 1㎕를 넣어준다.

4. 37℃ heat block에서 18∼20시간 동안 반응하여 당단백질에서 N-glycan을 분리한다.

B. GC(Graphitized Carbon) column을 이용한 절단된 N-glycan 회수

5. 0.1% TFA가 포함된 80% ACN 10㎖을 흘려 column을 activation 시킨다.

6. 정제수를 10㎖을 흘려준다.

7. PNGase F 효소를 이용하여 N-glycan 분리가 끝난 시료를 GC column에 흘려준다.

8. 정제수 10㎖을 흘려 column에 부착된 당사슬을 제외한 염과 단백질들을 제거 한다.

9. 0.075% TFA가 포함된 25% ACN 1㎖(elution buffer)을 흘려 N-glycan을 회수 한다.

10. 회수된 당사슬은 SpeedVac을 이용하여 건조한다.

※ 참고 ※

◆ 반응 총 량은 100㎕을 넘지 않는 것을 권장합니다.

◆ 건조된 당사슬은 -20℃에 보관하여 한 달 이상 사용 가능 합니다.