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Sample 내 desalting 을 위한 과정 - ZipTip protocols

Purpose : 시료 내에 포함된 salt (NaCl, Phosphate ) 제거하여 보다 target sample 이온화를 증가시키기 위한 방법과 target plate spotting 하기 위한 방법입니다.
 
Application :
1) Intact mass 분석할 단백질/펩티드에 salts 가이드라인 보다 과량 포함되어 있거나 상대적으로 analyte 농도가 희석이 되어 있을 .
 
2) Enzyme digestion 반응 이후 reaction b.f.  포함된 reagent 들이 펩티드의 이온화를 저해하는 경향이 강할 .
 
3) MALDI-TOF 장비 이외에 LC-Q-TOF 장비를 이어서 사용할 , 장비의 오염을 피할 중요하다
 
 
Material and reagents :
1. 50%(v/v) acetonitrile solution (solution A)
2. 01.% TFA 포함하는 LC grade water (solution B)
3. 01.% TFA 포함하는 70%(v/v) acetonitrile solution (solution C)
4. 01.% TFA 포함하는 50%(v/v) acetonitrile solution (solution D)
5. Sinapinic acid (matrix solution : 20mg – 30% acetonitrile solution(0.1% TFA))
6. 0.5% TFA 포함하는 LC grade water (solution E)
7. ZipTip C4 (Millipore)
 
Procedure
1. 우선, 시료 (4mg/ml) solution E 1:1 비율로 섞는다. (final TFA 농도는 0.25%)
 
2. ZipTip C4 equillibrium 위하여 micropippet 고정한 ZipTip C4 10ul solution A 5 이상 반복적으로 적신다.
 
3. ZipTip 최종 equillibrium 위하여 solution B 이용하여 다시 5 이상 반복적으로 적신후, 마지막에는 ZipTip C4 내에 남아있는 solvent 완전히 제거한다.
 
4. 1항에서 준비해 놓은 시료를 ZipTip 으로 주입과 drain 5 이상 반복한다.
 
5. ZipTip 내에 남아있는 unbound material 깨끗이 제거하기 위하여 solution B 이용하여 ZipTip 내에 주입과 drain 5 이상 반복한다.
 
6. 최종 bound 되어져 있는 protein 용출하기 위하여 solution C 10ul 3 ZipTip 세척하고 나오는 용액을 tube 모은다.
 
7. 용출된 용액을 vacuum pump centrifugal evaporator 이용하여 dry 시킨다.
( 30 정도, heater 40도로 설정한다.)
 
8. dry 시료가 남아 있는 tube sinapinic acid(또는 CHCA)  matrix solution( 20mg matrix solution D saturation 시키고  centrifuge filteration 통하여 남은 matrix particles 완전히 제거) 4ul 이용하여 완전히 녹인다.
 
9. 녹인 mixture 용액 1ul 96x2 well 각각 3 well spotting 실시하고 고른 crystal 형성을 위하여 vacuum pump desiccator 이용하여 실온에서 5~10분간 dry 시킨다.
10. sample matrix 공동으로 targeting plate 사용하여 MALDI-TOF 분석한다.
 
11. 정확한 분자량 측정을 위하여 linear /reflector positive mode 에서 external standard protein(peptide)  mix 이용하여 분자량을 측정한다. (자세한 parameter 설정은 보고서 표지를 기술함.)
 
12. 이때 분석된 mass 값을 calibration file 설정하고 시료의 이온화가 최적이며 동시에 baseline signal noise 최저인 조건하에서 설정된 값을 기본으로 반복적으로 측정한다.
 
13. well 4번에 걸쳐 acquisition 수행하여 수집된 spectrum file error 값의 편차가 가장 적은 4개의 mass spectra data 활용하여 평균 분자량을 산출 한다.
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