Purpose : 시료 내에 포함된 salt (NaCl, Phosphate 등)를 제거하여 보다 target sample 의 이온화를 증가시키기 위한 방법과 target plate 에 spotting 하기 위한 방법입니다.
Application :
1) Intact mass 를 분석할 단백질/펩티드에 salts 가 가이드라인 보다 과량 포함되어 있거나 상대적으로 analyte 의 농도가 희석이 되어 있을 때.
2) Enzyme digestion 반응 이후 reaction b.f. 에 포함된 reagent 들이 펩티드의 이온화를 저해하는 경향이 강할 때.
3) MALDI-TOF 장비 이외에 LC-Q-TOF 장비를 이어서 사용할 때, 장비의 오염을 피할 때 중요하다.
Material and reagents :
1. 50%(v/v) acetonitrile solution (solution A)
2. 01.% TFA 를 포함하는 LC grade water (solution B)
3. 01.% TFA 를 포함하는 70%(v/v) acetonitrile solution (solution C)
4. 01.% TFA 를 포함하는 50%(v/v) acetonitrile solution (solution D)
5. Sinapinic acid (matrix solution : 20mg – 30% acetonitrile solution(0.1% TFA))
6. 0.5% TFA 를 포함하는 LC grade water (solution E)
7. ZipTip C4 (Millipore)
Procedure
1. 우선, 시료 (4mg/ml) 와 solution E 를 1:1 비율로 섞는다. (final TFA 농도는 0.25%)
2. ZipTip C4 의 equillibrium 을 위하여 micropippet 에 고정한 ZipTip C4 에 10ul 의 solution A 를 5회 이상 반복적으로 적신다.
3. ZipTip 의 최종 equillibrium 을 위하여 solution B 를 이용하여 다시 5회 이상 반복적으로 적신후, 마지막에는 ZipTip C4 내에 남아있는 solvent 를 완전히 제거한다.
4. 1항에서 준비해 놓은 시료를 ZipTip 으로 주입과 drain 을 5회 이상 반복한다.
5. ZipTip 내에 남아있는 unbound material 을 깨끗이 제거하기 위하여 solution B 를 이용하여 ZipTip 내에 주입과 drain 을 5회 이상 반복한다.
6. 최종 bound 되어져 있는 protein 을 용출하기 위하여 solution C 를 10ul 씩 3회 ZipTip 을 세척하고 나오는 용액을 한 tube 에 모은다.
7. 용출된 용액을 vacuum pump 와 centrifugal evaporator 를 이용하여 dry 를 시킨다.
( 30 분 정도, heater 는 40도로 설정한다.)
8. dry 된 시료가 남아 있는 tube에 sinapinic acid(또는 CHCA) matrix solution( 20mg 의 matrix 를 solution D 에 saturation 시키고 centrifuge 와 filteration 을 통하여 남은 matrix particles 을 완전히 제거) 4ul 를 이용하여 완전히 녹인다.
9. 녹인 mixture 용액 1ul 를 96x2 well 에 각각 3 well 에 spotting 을 실시하고 고른 crystal 형성을 위하여 vacuum pump 와 desiccator 를 이용하여 실온에서 5~10분간 dry 를 시킨다.
10. sample 과 matrix 가 공동으로 targeting 된 plate 를 사용하여 MALDI-TOF 를 분석한다.
11. 정확한 분자량 측정을 위하여 linear /reflector 와 positive mode 에서 external standard 인 protein(peptide) mix 를 이용하여 분자량을 측정한다. (자세한 parameter 설정은 본 보고서 표지를 기술함.)
12. 이때 분석된 mass 값을 calibration file 로 설정하고 시료의 이온화가 최적이며 동시에 baseline 의 signal noise 가 최저인 조건하에서 설정된 값을 기본으로 반복적으로 측정한다.
13. 각 well 당 4번에 걸쳐 acquisition 을 수행하여 수집된 spectrum file 들 중 error 값의 편차가 가장 적은 4개의 mass spectra 를 data 로 활용하여 평균 분자량을 산출 한다.
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