본 방법은 N-terminal sequencing 을 위한 sample preparation 중, PVDF blotted protein 시료에 대한 관련 내용입니다.
전 단계로 전기영동 시에 sample loading b.f. 의 경우 DTT(2-mercaptoethanol)이 첨가된 b.f. 를 사용하시고 5분 정도 boiling 이후 gel 에 loading/running 을 진행하셔야 H-chain, L-chain 의 분리된 조건으로 전기영동이 진행됩니다. 전기영동 이후의 과정에 대하여 아래 기술하였습니다.
1. Materials
1) Towbin buffer : Transfer buffer (1) ( CAPs b.f. 를 사용하는 경우 Tris/Glycine 대신 CAPs 시약을 10mM 첨가 하시면 됩니다.)
25 mM Tris
142 mM Glycine
10% Methanol 100 ml ( MeOH contents depend on protein MW )
Up-to 1 liter by DW
Pre-chill the buffer before use
‘Don`t need to adjust pH’
2) Staining buffer for PVDF membrane ( Ponceus S/1.0% acetic acid )
0.02 % CBB R-250 10 mg
50% Methanol 20 ml
Up-to 50 ml by DW
3) Destaining buffer for PVDF membrane (Ponceus S staining : 3차 증류수로 destaining )
50% Methanol 40 ml
Glacial acetic acid 1ml
Up-to 100 ml by DW
(또는, 50% MeOH 로 사용해도 무관)
4) PVDF membrane ( 0.45um pore size )
5) 100% MeOH (HPLC grade)
2. Procedure
1) PVDF membrane 을 electro-blotting 직전에 100% MeOH 에 30초~1분간 soaking 합니다.
(soaking 이 끝난 후, membrane 이 건조되지 않게 transfer b.f. 에 보관합니다.)
2) Electro-blotting 의 조건은 일반적으로 western-blotting 방식과 동일하게 수행하되 이때, PVDF membrane 의 pore size 를 0.45um 를 권장하는 이유는 70~10kDa molecular weight 에 대한 protein 이 PVDF 상에 transfer 가 일정하게 되면서 불필요하게 protein 이 강하게 transfer 가 일어나지 않게 합니다.
3) Blotting 이 끝난 membrane 을 3차 증류수(Mili-Q)에 5분간 soaking 을 하도록 합니다.
- membrane 상에 남아 있는 glycine, Tris ( Edman reaction 효율을 낮추는 물질입니다.) 의 제거가 목적입니다.
4) Staining b.f. 를 이용하여 5분 이내로 staining 을 합니다.
- pre-staining maker (blue band 가 CBB dye 와 색깔이 구분되지 않을 정도까지 staining 을 진행하시면 됩니다. 금방 염색이 이루어지므로 관찰하면서 다음 과정을 진행하시면 됩니다.
5)Staining b.f. 를 버린 후, destaining b.f. 를 이용하여 바로 staining 이 끝난 membrane 을 몇차례 destaining b.f. 를 교환해 가면서 destaining 을 수행합니다.
(background 가 너무 하얗게 될 때까지 계속하실 필요는 없습니다.)
6) Band 가 명확히 보이는 시점에서 destaing b.f. 를 버린 후, 3차 증류수로 초산 냄새가 나지 않을 때까지 washing 을 실시한다. (Ponceus S 의 경우 destaining 용액이 3차 증류수 이므로 dry 만 시켜 주시면 됩니다.)
7) Rinse 가 끝난 membrane 은 air-dry 를 하여 membrane 을 충분히 dry 합니다.
그 외 참고할 Tip
1) Transfer b.f. 내의 MeOH %
단백질 분자량 : > 80kDa (70kDa) (5%)
단백질 분자량 : 20~80kDa (70kDa) (10%)
단백질 분자량 : < 20kDa (20%)
혹시 분자량이 다양한 protein band 들이 존재할 경우 일반적으로 10% 를 정해서 제조해 사용하시면 됩니다.
2) Towbin b.f. 사용 후 주의 사항
- Electroblotting 후 5분 간 3차 증류수로 membrane 을 washing 후 staining, destaining, rinse, dry 과정을 진행 ( Glycine 의 의도하지 않은 오염 peak 를 만들어 냅니다.)
3) Destaining 후 주의 사항
- Destaining b.f. 에 acetic acid 가 포함된 경우 꼭 3차 증류수로 5분간 rinse 를 하여 acetic acid 를 제거한다. (어떤 단백질/제조사별 membrane 의 경우 N말단을 blockage 를 유발 할 수 있음.)
4) Membrane 의 dry
- 1시가 이상 오랜 시간 동안 membrane 을 젖은 상태로 보관하는 경우 단백질의 N 말단 부분이 강하게 membrane 에 결합하여 의도하지 않는 과도한 효율의 저하 및 N-terminal blockage 를 유발할 수 있습니다.
5) Membrane 의 취급상의 주의
- Immune-blotting에서는 pore-size 가 큰 상관은 없으나 보통 > 20 kDa 단백질을 sequencing 하는 경우 pore size 는 0.45um 를 사용해주셔야 합니다. – membrane pore size가 02.um 인 경우 membrane 에 강하게 결합하는 이유가 됩니다. 그리고 불필요하게 2분 이상 100% MeOH 에 soaking 을 하는 경우에는 protein 이 blotting 시 불필요하게 강하게 membrane 에 결합될 수 있으며 staining 과 de-staining 이 정상적으로 이루어 지지 않아 dye 가 쉽게 제거되지 않는 문제를 야기합니다. 불필요하게 과다한 dye 역시 분석 과정에서 background 에 오염 peak 들의 생성을 유발할 수 있습니다.
![Electro-blotting_방식[1]_페이지_2.jpg](http://www.emass.co.kr/y4/data/cheditor4/1404/b3318456fbe3008394b2e2d9db68efde_9a1Q4fM6XbDb84n7Ybvf7U6aP2jbO4.jpg)
![Electro-blotting_방식[1]_페이지_1.jpg](http://www.emass.co.kr/y4/data/cheditor4/1404/b3318456fbe3008394b2e2d9db68efde_bUBjsFGqyinKuIWot.jpg)
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